Influência do tempo de centrifugação em testes de coagulação: tempo de protrombina e tempo de tromboplastina parcial / Influence of the centrifuge time in coagulation tests: prothrombin time and partial thromboplastin time

Objetivo: Analisar os testes de coagulação: tempo de protrombina (TP) e tempo de tromboplastina parcial (TTP) em diferentes tempos de centrifugação da amostra da biológica, com relação ao protocolo padrão do Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). Métodos: As amostras foram divididas em cinco alíquotas de 1 mL. Foi realizada a centrifugação em 15, 10, 5, 2 e 1 minuto, com velocidade de 1500 g. O TP e TTP foram imediatamente analisados em aparelho automatizado. Os plasmas foram analisados para presença de elementos residuais: eritrócitos, leucócitos e plaquetas. Resultados: Observou-se alteração dos valores do TP nos tempos de centrifugação 10, 5, 2 e 1 minuto e do TTP em 5, 2 e 1 minuto, com relação ao protocolo padrão. Na interpretação de Bland Altman, observou-se um viés significativo do limite clínico aceitável para o TP e para o TTP em todos os tempos de centrifugação, com relação ao protocolo padrão. Apenas no tempo de centrifugação de 15 minutos não foram encontradas células residuais nas amostras analisadas. Conclusão: O tempo de centrifugação de 15 minutos é o ideal para remoção completa das células sanguíneas residuais e para garantia da confiabilidade dos resultados dos testes de coagulação TP e TTP.

Objective: To analyze the coagulation tests: prothrombin test (PT) and partial thromboplastin time (PTT) in different centrifugation times of the sample, in relation to the standard protocol of the Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). Methods: The selected samples were splitted up into five aliquots of 1 mL. Centrifugation of these aliquots was carried out at 15, 10, 5, 2 and 1 minute at 1500 g. The PT and PTT were analyzed in an automated apparatus. The plasmas were analyzed for presence of residual elements: erythrocytes, leukocytes and platelets. Results: The results showed a change in the values of PT at the 10, 5, 2 and 1 minute centrifugation times and the PTT at 5, 2 and 1 minutes, relative to the standard protocol. In the interpretation of Bland Altman, a significant bias of the acceptable clinical limit for TP and TTP at all centrifugation times was observed, relative to the standard protocol. Only in the 15 minute centrifugation time no residual cells were found in the analyzed samples. Conclusion: The present study demonstrated that the 15-minute centrifugation time is ideal for complete removal of residual blood cells and to ensure the reliability of the results of the PT and PTT coagulation

Comprometimento hemostático em pacientes com icterícia obstrutiva / Haemostatic impairment in patients with obstructive jaundice

A doença hepática é associada à alterações hemostáticas devido à diminuição na síntese dos fatores de coagulação. Neste sentido, objetivou-se avaliar o comprometimento da hemostasia em pacientes com icterícia obstrutiva. Os pacientes foram analisados por gênero, idade, etiologia da doença, tempo de protrombina (TP) e tempo de tromboplastina parcial (TTP) antes e após a cirurgia. A icterícia obstrutiva ocorreu com maior frequência entre as mulheres (60,0%), sendo a coledocolitíase a causa mais comum da doença (80,0%). Os valores pré-cirúrgicos do TTP estavam dentro da faixa normal. No entanto, todos os pacientes apresentaram um TP prolongado na avaliação pré-operatória. Uma redução significativa (p<0,001) foi verificada na análise pós-operatória do TP, atingindo a faixa normal em 66,7% dos pacientes estudados. Verificou-se uma correlação positiva (r = 0,813 p<0,001) entre os valores pré-operatórios do TP e a idade dos pacientes. Além disso, os valores pré-operatórios e pós-operatórios do TP foram significativamente mais elevados (p<0,05) entre pacientes com icterícia obstrutiva de etiologia tumoral. Os resultados deste estudo demonstraram uma forte correlação entre a idade dos pacientes e a atividade dos fatores de coagulação vitamina K dependentes, além de uma diminuição significativa na atividade destes fatores em pacientes com icterícia obstrutiva de etiologia tumoral.

Liver disease is associated with haemostatic abnormalities due to the decreased synthesis of the clotting factors. Therefore, this study aimed to evaluate the impairment of haemostasis in patients with obstructive jaundice. Patients were analyzed by gender, age, cause of jaundice, prothrombin time (PT) and partial thromboplastin time (PTT) before and after surgery. Obstructive jaundice occurred more commonly amongst the females (60.0%), and choledocholithiasis was the most frequent cause of the disease (80.0%). Presurgical PTT values were within the normal range, whereas all the patients showed increased PT in the preoperative evaluation. A significant decrease (p<0.001) was found in the postoperative PT measurement, reaching the normal range in 66.7% of the studied patients. A positive correlation was found between the preoperative PT values and the age of the patients (r = 0.813 p<0.001). In addition, preoperative and postoperative PT values were significantly higher (p<0.05) among the patients with obstructive jaundice of tumoral etiology. Results from this study have shown that activity of vitamin K-dependent clotting factors in obstructive jaundice was strongly correlated with subject's age and was significantly decreased in patients with tumoral etiology.

Dabigatran en plasma: tiempos de trombina diluido, Ecarin y veneno de víbora de Russell diluido / Plasma dabigatran: diluted thrombin time, Ecarin and diluted Russell Viper Venom Time / Dabigatrana em plasma: tempos de trombina diluído, Ecarin e veneno de víbora de Russell diluído

Los objetivos del trabajo fueron verificar la calidad analítica del ensayo tiempo de trombina diluido (DTI) para medición de la concentración plasmática (cc) de dabigatran comparando dos coagulómetros de detección foto-óptica, comparar los resultados con el tiempo de Ecarin (ECT) y correlacionar las cc con las pruebas básicas de coagulación Tiempo de protrombina (TP), APTT y Tiempo de trombina (TT), y tiempo de veneno de víbora de Russell con fosfolípidos concentrados (DRVVTC). Se tomaron 43 muestras de plasma en el valle (10-14 h de la última toma) de 40 pacientes que recibían dabigatran. DTI y ECT presentaron (%) repetitividad <5,4% y <7,5%, CV interensayo <6% y <9%, respectivamente, en el protocolo EP15A2, aceptables para un Error Total permitido (TEa) <15%. Las cc medidas en pacientes fueron: mediana 83 (4-945) ng/mL. La comparación de equipos ACL TOP 300 y 500 dio resultados equivalentes por procedimiento alternativo de comparación de métodos. La comparación ECT vs. DTI fue satisfactoria por regresión de Deming (pendiente 1,143, ordenada al origen -19,33). Las correlaciones de cc vs. APTT, TP y DRVVTC fueron moderadas y no lineales tendiendo a plateau a cc>350 ng/mL, r2 0,59, 0,66 y 0,59, respectivamente. El TT fue extremadamente sensible: >120 s a cc 50 ng/mL. DTI presentó un buen desempeño analítico y permitió cuantificar dabigatran plasmático a cc bajas y altas en ambos equipos utilizados. ECT presentó resultados comparables a DTI. Se verifica una correlación moderada entre cc de dabigatran y las pruebas clásicas y DRVVTC, pudiendo ser estimadores de cc a partir de los 50 ng/mL.

The aims of the study were to verify the analytical performance of Dilute Thrombin Time (DTI) test to measure plasma dabigatran concentration (cc) in two photo-optical coagulometers, compare Ecarin clotting Time (ECT) and DTI results, and correlate cc with classical coagulation tests: prothrombin time (PT), APTT, thrombin time (TT) and diluted Russell Viper Venom Time tests with high phospholipid concentration (DRVVTC). Forty three plasma samples from 40 patients taking dabigatran were drown at through (10-14 hs.since last dose). DTI and ECT showed repetitivity (%) <5.4% and <7.5%, interassay CV <6% and <9%, respectively, following EP15A2 protocol, acceptable considering a Allowed Total Error (TEa)<15%. Patients` cc: median 83 (4-945) ng/mL. The comparison between ACL TOP 300 and 500 coagulometers showed equivalent results by using the alternative method comparison test. ECT vs. DTI: acceptable by Deming`s regression (slope 1.143, Y insert -19.33). cc vs. APTT, TP and DRVVTC: nonlinear and moderate correlations with plateau reached at cc >350 ng/mL, r2 0.59, 0.66 y 0.59, respectively. TT is extremely prolonged at cc >50 ng/mL. In conclusion: DTI showed a good analytical performance in both coagulometers. ECT showed comparable results to DTI. We verified that dabigatran cc presented moderate correlations with PT, APTT and DRVVTC, and that these tests could only qualitative estimate cc >50 ng/mL.

Os objetivos do trabalho foram verificar a qualidade analítica do ensaio tempo de trombina diluído (DTI) para medição da concentração plasmática (cc) de dabigatrana, comparando dois coagulômetros de detecção foto-óptica, comparar os resultados com o tempo de Ecarina (ECT) e correlacionar as cc com os testes básicos de coagulação Tempo de protrombina (TP), APTT e Tempo de trombina (TT), e tempo de veneno de víbora de Russell com fosfolipídios concentrados (DRVVTC). Foram tomadas 43 amostras de plasma no vale (10-14 h. da última toma) de 40 pacientes que recebiam dabigatrana. DTI e ECT apresentaram (%) repetitividade <5,4% e <7,5%, CV interensaio <6% e <9%, respectivamente, no protocolo EP15A2, aceitáveis para um Erro Total permitido (TEa) <15%. Cc medidas em pacientes: mediana 83 (4-945) ng/mL. Comparação de equipamentos ACL TOP 300 e 500: resultados equivalentes por procedimento alternativo de comparação de métodos. Comparação ECT vs. DTI: satisfatória por regressão de Deming (pendente 1,143, ordenada à origem -19,33). Correlações cc vs. APTT, TP e DRVVTC: moderadas e não lineares tendendo a plateau a cc>350 ng/mL, r2 0,59; 0,66 e 0,59, respectivamente. O TT é extremamente sensível: >120 s a cc 50 ng/mL. DTI apresentou um bom desempenho analítico e permitiu quantificar dabigatrana plasmática a cc baixas e altas em ambos os equipamentos utilizados. ECT apresentou resultados comparáveis com DTI. Verifica-se uma correlação moderada entre cc de dabigatrana e os testes clássicos e DRVVTC, podendo ser estimadores de cc a partir dos 50 ng/mL.

Variabilidade na sensibilidade à heparina de reagentes do TTPA em plasmas heparinizado in vitro e de pacientes heparinizados / Variability in heparin sensitivity of TTPA reagents in heparinized plasma in vitro and patients receiving heparin

Introdução: No final da década de 80 e início dos anos 90 vários estudos demonstraram a falta de padronização e a variabilidade nos resultados do TTPA devido a diferentes sensibilidades à heparina dos reagentes empregados para sua determinação. Objetivo: Avaliar a sensibilidade à heparina de reagentes utilizados para a determinação do TTPA em amostras de plasmas heparinizadas in vitro e de pacientes em uso de heparina não fracionada (HNF). Material e Métodos: Para este estudo foi utilizado um pool de plasma heparinizado, com concentrações de 0,1 até 1,0 unidade de heparina/mL, 29 pacientes em uso de HNF e 8 kits de reagentes para a determinação do TTPA. Resultados e Discussão: Com os plasmas heparinizados in vitro os resultados com o reagente da Actin® foram estatísticamente diferente dos da Labtest®, da Human® e da Clot®. O melhor coeficiente de correlação, resultado do TTPA versus concentração de HNF, foi observado com o reagente da Stago® (R=0,9919). Quando-se empregou os plasmas de pacientes em uso de HNF os resultados do Actin® e do Actin FSL® foram estatisticamente diferentes dos da Clot®. Conclusão: Diferenças estatisticamente significativas, nos valores de TTPA, ainda são observadas, tanto em plasmas de pacientes em uso de HNF como em plasmas heparinizados in vitro de acordo com o reagente utilizado.

Introduction: At the end of the 1980s and at the beginning of the 1990s, several studies showed lack of standardization and variability in APPT results due to the different sensibilities to heparin in reagents used for its determination. Objective: To evaluate the sensibility to heparin in the different reagents used to determine APPT in samples of heparinized plasma in vitro and in patients using non-fractioned heparin (NFH). Material and Methods: This study was performed with a pool of heparinized plasma with concentrations from 0.1 to 1.0 unit heparin/mL, 29 patients using NFH and 8 reagent kits for TTPA determination. Results and Discussion: Using heparinized plasma in vitro, there was a statistically significant difference with Actin® reagent in relation to Labtest®, Human® and Clot® reagents. The best correlation coefficient, a result of the APTT versus UFH concentration was observed with reagent from Stago® (R = 0.9919). When we used the plasma from patients using UFH, the results of Actin ® and Actin FSL® were statistically different from the Clot®.

Avaliação do pool de plasma caseiro como controle normal para o tempo de tromboplastina parcial ativada (TTP) / Evaluation if in-house preparations of polled plasma can be used as a normal control of partial thromboplastin time (PTT)

INTRODUÇÃO: A utilização correta de um plasma-controle para a comparação com o plasma do paciente nos testes de coagulação é fundamental para a garantia de um resultado seguro dessas provas laboratoriais. OBJETIVO: O presente estudo analisou a viabilidade do uso de um pool de plasma caseiro, realizado com cinco (P5) e 20 (P20) amostras a partir de pacientes normais, para ser utilizado como controle normal do tempo de tromboplastina parcial (TTP). MATERIAL E MÉTODO: Os dois pools de plasma caseiro foram analisados em relação a um controle normal comercial (AP). Foram 10 dias de experimento e a cada dia os dois pools caseiro eram feitos. Para cada dia foi feito o TTP de P5, P20 e AP. Todos os pacientes com solicitação de TTP, em cada dia do experimento, tiveram a relação de tempos (R) determinada frente a P5, P20 e AP. As ferramentas estatísticas utilizadas foram média (X), análise de variância e teste de Tukey. RESULTADOS: A análise estatística demonstrou que os valores de TTP são significativamente diferentes entre AP e P5 e entre AP e P20, mas não há diferença significativa entre P5 e P20. Quando a relação de tempos foi analisada, não houve diferença significativa entre AP, P5 e P20. CONCLUSÃO: O estudo demonstrou que pode ser utilizado como controle normal um pool de plasma caseiro, feito a partir de cinco ou 20 amostras.

INTRODUCTION: Proper utilization of plasma control for comparison with the plasma of patients with coagulation tests is critical to ensure a safe outcome of these laboratory tests. OBJECTIVE: The purpose of this work was to know if in-house preparations of polled plasma can be used as a normal control of partial thromboplastin time (PTT). MATERIAL AND METHOD: We make two polled plasma, one with five (P5) samples and another with 20 (P20) samples, both of them from normal patients. Both pooled plasma were analyzed in comparison with a commercial lyophilized control (AP). The experiment was performed in 10 days, and P5 and P20 were made daily. At each day PTT was performed for P5, P20 and AP. All patients who asked for TTP, in each day of this experience, got a time relation (R) determined by a P5, P20 e AP. Tukey test was used as statistical analysis. RESULTS: Statistically significant differences were detected among the PTT for AP and P5, AP and P20, but no difference between P5 and P20 was observed. When the time relations were tested, there were no significant difference, among AP, P5, and P20. CONCLUSION: We found that in-house preparations of polled plasma (P5 and P20) can be used as a normal control of PTT.

Biological potency evaluation and physicochemical characterization of unfractionated heparins

Unfractionated heparins are used clinically as anticoagulants. The biological potency of thirteen samples of raw material and pharmaceutical formulations were assessed utilizing the 5th International Standard of heparin using the sheep plasma coagulation inhibition assay, activated partial thromboplastin time, anti-factor Xa assay, and anti-factor IIa assay, resulting in mean potencies of 101.15 percent, 96.15 percent, 98.15 percent and 99.37 percent, respectively. The samples were also evaluated by the protamine neutralization test giving results within the range of 92 - 138 IU/mg. The anti-factor IIa assay was performed showing reproducibility and significant correlation with the pharmacopoeial assays, thus demonstrating it to be a feasible alternative to the sheep plasma coagulation inhibition assay. Moreover, an analysis by nuclear magnetic resonance and capillary electrophoresis showed some peaks attributable to oversulfated chondroitin sulfate. The results show that batch-to-batch variations and the quality of samples contributed to improvements in the quality control of pharmaceutical products and to assure the safe use and clinical efficacy of this biological medicine.

As heparinas não fracionadas são utilizadas clinicamente como anticoagulantes. A potência biológica de 13 amostras de matérias-primas e produtos farmacêuticos foram avaliadas em relação ao 5ª Padrão Internacional de heparina pelos ensaios da inibição da coagulação do plasma ovino, tempo de tromboplastina parcial ativada, anti-fator Xa e anti-fator IIa, que forneceram potências médias de 101,15 por cento, 96,15 por cento, 98,15 por cento e 99,37 por cento, respectivamente. As amostras foram também submetidas ao teste de neutralização pela protamina que apresentou resultados entre 92-138 UI/mg. Demonstrou-se reprodutibilidade e correlação significativa do ensaio do anti-fator IIa com os farmacopeicos, constituindo-se em alternativa ao ensaio da inibição da coagulação do plasma ovino. Além disso, as análises realizadas por ressonância magnética nuclear e eletroforese capilar mostraram picos correspondentesà condroitina supersulfatada. Os resultados mostraram variações lote-a-lote e a qualidade das amostras contribuindo para aprimorar o controle de qualidade dos produtos farmacêuticos e garantir a segurança e eficácia terapêutica desses produtos biológicos.